项目动态 | 打破CNV-seq技术局限，博奥晶典自主研发基于CNV-seq测序数据的ROH检测系统

什么是ROH？

基因组纯合区域（regions of homozygosity, ROH）是指基因组区域中一定范围内连续呈现的杂合性丢失的现象。对于大部分的二倍体细胞如人类体细胞，拥有两份基因组，一份来自于父亲，另一份来自于母亲。在某一个等位基因位点上，如果来自父本和母本的碱基不同时，则该位点为杂合（heterozygous）；如果因为某种机制（如远亲关系或近亲关系婚姻或基因转换）导致在一定范围内连续的等位基因序列都是纯合子而无杂合子（拷贝数仍为 2 个），则该区域为ROH。如检出多条染色体上均存在大片段 ROH 时需考虑父母亲缘关系（consanguinity）；如果仅在一条染色体发现≥10Mb的ROH，应优先考虑单亲二体（uniparental disomy，UPD）的可能。

什么是UPD？

UPD是指一个个体的两条同源染色体都来自同一亲本，或来自父母一方的染色体片段被另一方的同源部分取代。UPD的产生机制主要有三体细胞自救、单体细胞的自身复制（单体自救）等。Nakka等对440多万份样本研究后发现，UPD在活产儿中的发生率可达1/2000。当UPD出现在基因印记区域时，子代可能会遗传两个均有表达活性的等位基因，也可能遗传两个表达沉默的等位基因，从而导致基因剂量表达异常。

目前已知当第 6、7、11、14、15及20号染色体存在UPD时，可通过基因组印迹障碍导致疾病的发生。常见的UPD综合征及主要表型详见表1，其中Angelman 综合征发病率约为1/20,000-1/12,000，临床表型包括小头，共济失调，癫痫，智力发育迟滞，语言能力差，微笑面容。

大多数染色体UPD没有临床表型，当UPD发生在印记基因区域则会导致印记基因异常，出现异常的表型。目前针对上述UPD综合征（表1）尚无有效的治疗手段，因此，早发现、早诊断、早干预对于此类疾病的防控尤为重要。

产前筛查或诊断中如果发现涉及第 6、7、11、14、15及20号染色体的嵌合、NIPT筛查三体高风险或相关超声异常（如父源性14号染色体UPD的特殊钟形胸廓）或涉及14、15号染色体的罗伯逊易位、平衡易位等，应考虑进行UPD检测。2020年ACMG指南发布了关于UPD产前诊断的声明，建议对如下人群在产前诊断时应检测UPD：孕妇高龄；采用PGT助孕，打算植入有印记染色体嵌合胚胎；穿刺绒毛或穿刺羊水提示印记染色体三体或单体嵌合；产前超声异常与某种UPD疾病表型一致；绒毛穿刺或羊水穿刺提示存在遗传的或新发的涉及14号或15号染色体的罗氏易位或者等臂染色体；新发的小标记染色体（sSMC），但不带有明显常染色质；发生在非罗氏易位的印迹染色体的3：1分离可能导致三体或单体挽救或配子补救。

UPD的检测方法

UPD的检测方法主要包括STR分型技术、SNP分型技术、甲基化PCR与甲基化MLPA 技术。其中最为经典的是STR分析，但通常不用于一线筛查，商业化的STR检测试剂盒仅检测特定的STR位点，难以覆盖常见的UPD综合征。基于SNP分型的UPD检测技术主要包括染色体微阵列分析技术（chromosomal microarray analysis, CMA）、全外显子组测序等方法，通过分析SNP位点的杂合性识别ROH，仅适用于单亲同二体型的UPD检测，检测灵敏性和分辨率与SNP探针的密度和分布有关。甲基化PCR和MLPA技术直接针对目标UPD综合征相关的关键印记基因的甲基化状态进行分析，对于病因的确诊有重要意义，通常用于UPD验证。

CNV-seq技术是基于低深度全基因组测序的新一代拷贝数变异检测方法，具有通量高、操作简便、兼容性高等优势，对于小的CNV以及低比例嵌合的CNV具有良好的检测效能，在临床得到了广泛的应用。但是，业内普遍认为CNV-seq技术仅适用于染色体拷贝数变异的检测，无法检测单亲二倍体UPD在内的ROH，这在一定程度上限制了CNV-seq在产前诊断中的应用。2019年4月发布的《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》建议，临床高度怀疑胎儿为单亲二倍体时，应结合STR或 SNP array等技术进行检测。

目前临床应用的CNV-seq测序技术覆盖的SNP位点reads的平均深度1X左右，难以识别UPD和ROH。通过提高测序深度，或基于高深度测序法虽然可以解决UPD和ROH的检测问题，但测序成本会随着测序深度的增加而大幅增加。因此，如何使用低测序深度的数据满足ROH/UPD的检测需要，是一项极具挑战的工作。

针对上述难题，博奥晶典的研究科学家们开发了基于全基因组低深度测序CNV-seq的ROH检测技术，此项技术于2020年8月获发明专利授权（ZL202010896507.5）。本方法基于生物信息学分析方法的创新实现ROH的检测，在不增加测序深度、测序成本和实验操作的情况下，能支持深度低至0.1~0.2X的ROH检测。研究组基于临床CNV-seq 0.15~0.4X的测序深度数据开创性地提出SNP混合杂合度指标（SMHS）的计算方法，表明在极低测序深度下（低至0.2X覆盖深度），虽然每个SNP位点的基因型不可知，但是通过合并计算N个SNP杂合信息，计算SMHS得分可以检测多倍体和ROH。

该算法打破了现有低平均测序深度数据不能用于判断ROH和多倍体的局限，这意味着不增加检测数据量的条件下就可以分析多倍体和ROH区域，不仅能显著降低检测成本还能缩短检测周期，给产前诊断工作和社会带来巨大效益。

图1：博奥晶典基于CNV-seq测序数据检测多倍体和基因组纯合区域ROH的系统专利技术